Tahukah anda apa itu PCR? PCR adalah teknik yang digunakan di laboratorium untuk membuat jutaan salinan bagian tertentu DNA. Ini pertama kali dikembangkan pada 1980-an.
Apa itu PCR?
Reaksi rantai polimerase (PCR) awalnya dikembangkan pada tahun 1983 oleh ahli biokimia Amerika Kary Mullis. Dia dianugerahi Hadiah Nobel Kimia pada tahun 1993 untuk pekerjaan perintisnya.
PCR digunakan dalam biologi molekuler untuk membuat banyak salinan (memperkuat) bagian kecil DNA atau gen. Dengan menggunakan PCR, dimungkinkan untuk menghasilkan ribuan hingga jutaan salinan bagian tertentu DNA dari sejumlah kecil DNA.
PCR adalah alat yang umum digunakan di laboratorium penelitian medis dan biologi. Ini digunakan pada tahap awal pemrosesan DNA untuk sekuensing ? , untuk mendeteksi ada atau tidaknya gen untuk membantu mengidentifikasi patogen ? selama infeksi, dan saat membuat profil DNA forensik dari sampel kecil DNA.
Bagaimana cara kerja PCR?
Untuk memperkuat segmen DNA menggunakan PCR, sampel terlebih dahulu dipanaskan sehingga DNA berubah sifat, atau terpisah menjadi dua bagian DNA untai tunggal. Selanjutnya, enzim yang disebut “Taq polimerase” mensintesis – membangun – dua untai DNA baru, menggunakan untai asli sebagai cetakan. Proses ini menghasilkan duplikasi DNA asli, dengan masing-masing molekul baru mengandung satu untai DNA lama dan satu untai DNA baru. Kemudian masing-masing untaian ini dapat digunakan untuk membuat dua salinan baru, dan seterusnya, dan seterusnya. Siklus denaturasi dan sintesis DNA baru diulang sebanyak 30 atau 40 kali, menghasilkan lebih dari satu miliar salinan persis dari segmen DNA asli.
Seluruh proses siklus PCR otomatis dan dapat diselesaikan hanya dalam beberapa jam. Ini diarahkan oleh mesin yang disebut termosikler, yang diprogram untuk mengubah suhu reaksi setiap beberapa menit untuk memungkinkan denaturasi dan sintesis DNA.
Prinsip di balik setiap PCR, apa pun sampel DNA-nya, adalah sama. Lima ‘bahan’ inti diperlukan untuk menyiapkan PCR. Kami akan menjelaskan dengan tepat apa yang masing-masing lakukan saat kami berjalan. Ini adalah:
- Templat DNA yang akan disalin
- Primer, bentangan pendek DNA yang memulai reaksi PCR, dirancang untuk mengikat kedua sisi bagian DNA yang ingin Anda salin
- Basa nukleotida DNA ? (juga dikenal sebagai dNTP). Basa DNA (A, C, G dan T) adalah blok pembangun DNA dan diperlukan untuk membangun untai DNA baru
- Enzim Taq polimerase ? untuk menambahkan basis DNA baru
- Buffer untuk memastikan kondisi yang tepat untuk reaksi.
PCR melibatkan proses pemanasan dan pendinginan yang disebut siklus termal yang dilakukan oleh mesin.
Ada tiga tahapan utama:
Denaturasi
Ketika DNA template untai ganda dipanaskan untuk memisahkannya menjadi dua untai tunggal.
Anil
Ketika suhu diturunkan untuk memungkinkan primer DNA menempel pada DNA cetakan.
Tahap Memperluas
Ketika suhu dinaikkan dan untai DNA baru dibuat oleh enzim polimerase Taq.
Ketiga tahap ini diulangi 20-40 kali, menggandakan jumlah salinan DNA setiap kali.
Reaksi PCR lengkap dapat dilakukan dalam beberapa jam, atau bahkan kurang dari satu jam dengan mesin berkecepatan tinggi tertentu.
Setelah PCR selesai dibuat, metode yang disebut elektroforesis dapat digunakan untuk memeriksa kuantitas dan ukuran fragmen DNA yang dihasilkan.
Apa yang terjadi pada setiap tahap PCR?
Tahap Denaturasi
Selama tahap ini, koktail yang berisi DNA cetakan dan semua bahan inti lainnya dipanaskan hingga 94-95⁰C. Suhu tinggi menyebabkan ikatan hidrogen ? antara basa dalam dua untai DNA cetakan untuk dipecah dan dua untai untuk memisahkan.
Ini menghasilkan dua untai DNA tunggal, yang akan bertindak sebagai templat untuk produksi untaian DNA baru. Penting agar suhu dipertahankan pada tahap ini cukup lama untuk memastikan bahwa untaian DNA telah terpisah sepenuhnya. Ini biasanya membutuhkan waktu antara 15-30 detik.
Tahap anil
Selama tahap ini reaksi didinginkan hingga 50-65⁰C. Hal ini memungkinkan primer untuk melekat pada lokasi tertentu pada DNA template untai tunggal melalui ikatan hidrogen (suhu yang tepat tergantung pada suhu leleh primer yang Anda gunakan).
Primer adalah untaian tunggal DNA atau RNA urutan yang panjangnya sekitar 20 sampai 30 basis. Adanya primer dirancang untuk saling melengkapi dalam urutan ke bagian pendek DNA di setiap ujung urutan yang akan disalin.
Primer berfungsi sebagai titik awal untuk sintesis DNA. Enzim polimerase hanya dapat menambahkan basa DNA ke untai ganda DNA. Hanya setelah primer terikat, enzim polimerase dapat menempel dan mulai membuat untai pelengkap baru DNA dari basis DNA yang lepas.
Dua untai DNA yang terpisah saling melengkapi dan berjalan dalam arah yang berlawanan (dari satu ujung – ujung 5 ‘- ke ujung lainnya – ujung 3’); Akibatnya, ada dua primer – primer maju dan primer terbalik. Langkah ini biasanya membutuhkan waktu sekitar 10-30 detik.
Tahap Memperluas
Selama langkah terakhir ini, panas ditingkatkan menjadi 72⁰C untuk memungkinkan DNA baru dibuat oleh enzim polimerase DNA Taq khusus yang menambahkan basa DNA.
Taq DNA polimerase adalah enzim yang diambil dari bakteri pencinta panas (Thermus aquaticus).
- Bakteri ini biasanya hidup di sumber air panas sehingga dapat mentolerir suhu diatas 80⁰C.
- DNA polimerase bakteri sangat stabil pada suhu tinggi, yang berarti dapat menahan suhu yang dibutuhkan untuk memecah untaian DNA dalam tahap denaturasi PCR.
- DNA polimerase dari sebagian besar organisme lain tidak akan mampu menahan suhu tinggi ini, misalnya, polimerase manusia bekerja idealnya pada 37˚C (suhu tubuh).
72⁰C adalah suhu optimal untuk polimerase Taq untuk membangun untai komplementer. Ini menempel pada primer dan kemudian menambahkan basis DNA ke untai tunggal satu per satu dalam arah 5 ‘ke 3’.
Hasilnya adalah untai DNA baru dan molekul DNA beruntai ganda. Durasi langkah ini tergantung pada panjang sekuens DNA yang diperkuat tetapi biasanya membutuhkan waktu sekitar satu menit untuk menyalin 1.000 basis DNA (1Kb).
Ketiga proses siklus termal ini diulangi 20-40 kali untuk menghasilkan banyak salinan dari urutan DNA yang diinginkan.
Fragmen DNA baru yang dibuat selama PCR juga berfungsi sebagai templat tempat enzim DNA polimerase dapat menempel dan mulai membuat DNA.
Hasilnya adalah sejumlah besar salinan dari segmen DNA spesifik yang diproduksi dalam waktu yang relatif singkat.
Untuk apa PCR digunakan?
Setelah diamplifikasi, DNA yang dihasilkan PCR dapat digunakan di banyak prosedur laboratorium yang berbeda. Misalnya, sebagian besar teknik pemetaan dalam Proyek Genom Manusia (HGP) mengandalkan PCR.
PCR juga berharga di sejumlah laboratorium dan teknik klinis, termasuk sidik jari DNA, deteksi bakteri atau virus (terutama AIDS), dan diagnosis kelainan genetik.
Tujuan PCR (polymerase chain reaction)
Untuk melakukan PCR, DNA asli yang ingin disalin tidak perlu murni atau berlimpah. Ini bisa murni tetapi juga bisa menjadi bagian kecil dari campuran bahan. Jadi, PCR telah menemukan kegunaan yang luas dan tak terhitung banyaknya – untuk mendiagnosis penyakit genetik, melakukan sidik jari DNA, menemukan bakteri dan virus , mempelajari evolusi manusia, mengkloning DNA mumi Mesir, membangun hubungan ayah atau biologis, dll. Dengan demikian, PCR telah menjadi alat penting bagi ahli biologi, laboratorium forensik DNA, dan banyak laboratorium lain yang mempelajari materi genetik.
Seiring dengan berkembangnya PCR, harus ditinjau kembali secara berkala. Hal ini dimaksudkan agar kinerja PCR tetap berada pada jalur yang benar dan bekerja secara efektif dan efisien. Agar PCR berjalan lancar, serta terintegrasi dengan sistem, gunakanlah JojoTimes. Dengan satu aplikasi, kamu dapat memantau produktivitas dan memaksimalkan kinerja karyawan kapan saja dan dimana saja. Selain itu, JojoTimes juga membantu meminimalisir pekerjaan yang berulang, guna memaksimalkan PCR yang telah ditentukan. Sangat cocok bagi perusahaan yang ingin mencapai hasil terbaik.
